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酶联免疫吸附实验(ELISA)

ELISA检测的目的是为实验提供准确可靠的定量分析实验依据。为了保证实验数据的可靠性,在实验过程中必须坚持全面质量控制和全过程质量控制。在收集标本前都必须有一个完整的计划。

• 注意事项:

 每个标本量收集体积= 100ul × 检测种类,如要做复孔,标本量收集体积= 100ul × 检测种类×2 。

 对于作某一个具体指标来说,最好先用一系列稀释度作一批标本测定,得出对实验有意义的一个稀释度(即测定剂量反应曲线),然后用一个最适稀释度测定即可。

 收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本,储存在 4  备用,如有特殊原因需要周期收集标本,将标本及时分装后放在 -20  或 -70  条件下保存。避免反复冻融。标本 2 -8  可保存 48 小时, -20  可保存 1 个月。 -70 度可保存 6 个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。

 血清标本采集时,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。

 为了保证尿液检测结果的准确性,必须正确收集尿液标本和保存。盛尿容器要清洁干燥。

最好使用一次性的容器(如塑料尿杯),避免因用药并清洗不干净而造成的污染,影响

检测结果。尿液标本必须新鲜,留取后,应及时检测或保存,以免细菌繁殖。因在室温

中久置后(尤其是夏季)尿中磷酸盐等可析出结晶而干扰检测。

 标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性

反应。保存过久可发生聚合在ELISA中可使本底加深。

 冻结标本融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。

 混浊或有沉淀的标本应先离心或过滤,澄清后再检测。

 反复冻融会使蛋白效价降低,所以待测标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。也可加入适当防腐剂。

 如果您在实验中遇到任何特殊问题,敬请咨询 400-821-2178

• 标本类型

ELISA常见的标本一般包括:

 液体类标本:包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

 培养细胞

 组织标本

这些标本收集的时间、方法和保存都有一定的要求。

• 标本的保存

一般说来,在5天内测定的标本可放置于4,超过一周测定的需低温冻存。

对收集后当天进行检测的标本,储存在 4  备用,如有特殊原因需要周期收集标本,

将标本及时分装后放在 -20  或 -70  条件下保存。避免反复冻融。

标本 2 -8  可保存 48 小时, -20  可保存 1 个月。 -70 度可保存 6 个月。部分标本也可加入适当防腐剂,激素类标本需添加抑肽酶。

• 标本的处理

可用作ELISA测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液)、细胞培养上清、细胞、组织等均可作标本以测定其中某种成份。有些标本可直接进行测定,有些则需经预处理。

 血清:

室温血液自然凝固 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。收集上清。如有沉淀形成,应再次离心。

 血浆:

应根据试剂盒的要求选择 EDTA 、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,加入 10 %( v/v )抗凝剂 ( 0.1M 柠檬酸钠或 1% heparin 或 2.0%EDTA.Na2) 混合 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。如有沉淀形 成,应再次离心。

 尿液、胸腹水、脑脊液:

用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。如有沉淀形成,应再次离心。

 细胞培养上清:

检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。检测细胞内的 成份时,用 PBS ( PH7.2-7.4 )稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

 组织标本:

切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS或组织蛋白萃取试剂,缓冲液中可加入蛋白酶抑制剂。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清置于 -20 度或 - 70 度保存,如有必要,可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

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