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基因敲除技术

1、CRISPR技术

原核生物规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。CRISPR/Cas是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中,crRNA(CRISPR derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA,此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。目前,CRISPR/Cas9技术已经成功应用于大小鼠基因的KO/KI模型制备。

 

流程

1、gRNA载体构建

2、gRNA和Cas9体外转录成mRNA

3、mRNA显微注射(F0模型生产)

4、F1模型生产

CRISPR/Cas9技术特点和优势

1、可实现对靶基因多个位点同时敲除。

2、实验周期短,最快仅需2个月。

3、无物种限制。

2、TALEN靶向敲除技术

TALEN(transcription activator-like (TAL) effector nuclease)技术是基于对DNA识别的TALEN臂和人工改造的核酸内切酶的切割域(Fok I)的结合对细胞基因组进行修饰而实现的。TAL的核酸识别单位由34个氨基酸组成,其与DNA序列结合的特异性取决于第12位和第13位氨基酸残基(重复可变的双联氨基酸位点,RVDs)。RVDs和A、T、C、G就恒定的对应关系,即NI识别A、NG识别T、NN识别G、HD识别C。因此,要识别特定的核酸序列,只需将TAL识别模块按照对应的核苷酸序列串联组装即可,通常会在目的基因中选择两处相邻(间隔15-20个碱基)的靶序列(长度为16-20bp的DNA序列)分别进行TALE识别模块的构建。通过DNA识别域结合到靶位点上,以及FokI的切割域形成二聚体后,可特异性对目标基因DNA实现切断。在非同源末端连接修复过程中,DNA双链断开后会由于碱基的随机增减造成目标基因功能缺失。该技术目前已成功应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类模式动物的研究领域。

流程

1、设计、构建TALEN质粒

2、TALEN质粒体外转录成mRNA

3、mRNA原核显微注射(F0小鼠生产)

4、F1小鼠生产

技术特点

1、无基因序列、细胞、物种限制,几乎可敲除任意基因。

2、实验设计简单准确、实验周期短、成本低。

3、毒性低、脱靶情况少;成功率几乎可达100%。

4、TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。

5、可识别任意目标基因序列,且不受上下游序列影响。

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